Oral (ağız-boğaz) ve akciğeri iyileştirmek için olası bir probiyotik (S. salivarius K12) yaklaşımı, Mikrobiyotalar ve SARS-CoV-2'ye karşı savunmayı arttırmak

Francesco Di Pierro (Bilimsel Direktör, Velleja Research, Milano, İtalya) Yazışmalar: f.dipierro@vellejaresearch.com

Anahtar Kelimeler: Streptococcus salivarius, koronavirüs, COVID-19, interferon, pnömoni

A possible probiotic (S. salivarius K12) approach to improve oral and lung microbiotas and raise defenses against SARS-CoV-2 Journal: Minerva Medica Paper code: Minerva Med-6570 Submission date: March 31, 2020 Article type: Letter to the Editor Files: 1. Manuscript Version: 1 Description: Manoscritto originale File format: application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.document 2. Figures 1 Version: 1 Description: Figure 1 e 2 File format: application/pdf A possible probiotic (S. salivarius K12) approach to improve oral and lung microbiotas and raise defenses against SARS-CoV-2 Francesco Di Pierro (Scientific Director, Velleja Research, Milan, Italy) Correspondence: f.dipierro@vellejaresearch.com Keywords: Streptococcus salivarius, coronavirus, COVID-19, interferon, pneumonia

Oral(ağız-boğaz) ve Akciğer Mikrobiyotasını Düzenlemek ve SARS-CoV-2’ye Karşı Savunma Mekanizmasını Güçlendirmek için Potansiyel Probiyotik (S. Salivarius K12) Yaklaşımı SARS-CoV-2 adlı yeni bir beta-coronavirüsün neden olduğu bir patoloji olan 2019 koronavirüs hastalığı (COVID-19) hızla yayılıyor ve tüm dünyada bilim adamları etkin bir tedavi için ilaçlar ve insan yaşamını korumak için aşılar geliştirmek için çalışıyor. SARS-CoV-2’nin gen dizilimi, 2002 ve 2003'te büyük bir salgına neden olan SARS-CoV ile %79 oranında aynıdır. SARS-CoV-2 de SARS-CoV gibi, akciğer hücrelerine bağlanmak için ACE-2 reseptörünü kullanarak şiddetli hatta ölümcül olabilecek bir pnömoniye neden olabilir.

Bulaşma vakalarının çoğu, soluk alıp verirken oluşan damlacıkların bir diğer kişiye transferiyle ya da etraftaki yüzeylerden ellere ve oradan ağız ve buruna geçmesiyle meydana gelir. Her iki şekilde de virüs, ilk olarak üst solunum yoluna oradan da akciğerlere yayılabilir (1). Oral mikrobiyota ve üst solunum yolu mikrobiyotası, Streptococcus cinsine ait türlerin büyük bir kısmını içerir; hem insanlarla beraber ortak yaşayan streptokoklar hem de patojenik olan streptokoklar, çeşitli stratejiler kullanarak uygun bir yer için rekabet ederler.

Örneğin, streptokoklar, fermantasyon yoluyla karbonhidratları metobolize etme konusunda çok yeteneklidirler ve bu şekilde yan ürün olarak asit üretirler. Streptococcus mutans gibi asidürik türler tarafından oral ortamın aşırı asitli hale getirilmesi, diş çürüklerinin oluşumu ile doğrudan ilişkilidir. Bununla birlikte, Streptococcus salivarius gibi daha az asit toleranslı türler de büyük miktarlarda alkali üretebilir, böylece ağız boşluğunun asit-baz fizyolojisinde önemli bir rol oynar.

Streptococcus salivarius, üst solunum yolu mikrobiyotasının sayısal olarak önde gelen temel üyelerindendir ve tekrarlayan farenjit, bademcik iltihabı ve akut otitis mediaya yol açan, yine bu türün patojen üyelerinden Streptocuccus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis ve Haemophilus influenzae'ya karşı gösterdiği bakteri etkileşimi gözlemlenmiştir (2). K12 (3) olarak bilinen belirli bir Streptococcus salivarius suşunun klinik olarak stabil bir üst solunum yolu mikrobiyotasının oluşumunda rol oynadığı, böylece konakçıyı patojenik bakterilerden, mantarlardan ve virüslerden koruyarak streptokokal tonsillofarenjit insidansını, akut ve salgılı otitis mediayı, halitosis (ağız kokusunu), oral pamukçuk ve viral enfeksiyonlarını (rinit, grip, farenjit, larenjit, tracheitis ve enterit) azalttığı gösterilmiştir.

K12 suşunun antibakteriyel rolü, bakteriyosinlerin (Salivarisin A2 ve Salivarisin B) salınmasına ve bunların, duyarlı olan patojenik bakterilerin zarlarında instabiliteye yol açmasına bağlanmıştır. AntiCandida etkisinin başlıca nedeni ise K12 suşunun oral mukozaya yapışırken mantar hifaları ile rekabet etme yeteneğinden kaynaklanıyor gibi görünmektedir.

K12 suşunun antiviral etkisinin, oral pastil uygulamasından 10 saat sonra insan tükürüğündeki IFN-y seviyelerinin 24 saatte 22-139 pg/ml değerleri arasında saptanmasıyla oluşmuş bir bağışıklık tepkisinin gelişiminin gözlemlenmesiyle olduğu öne sürülmektedir (Şekil 1) (4).

Şekil 1:

İntrinsik antiviral aktiviteler, interferon ile indüklenen proteinler aracılığıyla oluşur ve nitrik oksit sentazın indüklenmesine neden olabilir, bu da hücrede RNA bozunumunu etkileyerek ve hücre apoptozunu indükleyerek, virüsün yaşayabilirliğini doğrudan etkileyebilir. IFN-y salınımı, IL-1β veya TNF-α seviyelerini değiştirmeden ve IL-8 salınımını önemli bir ölçüde düşürmeden gerçekleştiği için enflamatuar bir yanıt oluşumuna sebep olmaz. Dahası, Streptococcus salivarius K12, NF-κB yolaklarını ve insanların bağışıklık hücrelerindeki başka önemli fonksiyonları inhibe ederek bronşiyal enflamatuar yanıtları baskılayabilme yeteneğine sahiptir. Virüsler NF-κB yolunu modüle edecek bir yetkinlik geliştirdikleri için, bu son bulgu oldukça önemlidir; böylece replikasyonlarını artırırlar ve konakçı hücrenin hayatta kalış süresini azaltır ve konakçı immün yanıtlarının kaybolmasına yardımcı olurlar.

Anatomik ve fizyolojik değerlendirmeler, ağız boşluğunun, mikroaspirasyon ve inhalasyon yoluyla oluşan akciğer mikrobiyota topluluğunun birincil kaynağı olduğunu göstermektedir (5). Gerçekten de, sağlıklı akciğerlerin mikrobiyotaları, ağızdakilerle örtüşmektedir. Sağlıklı deneklerden edinilen bronkoalveoler lavaj sıvısı örneklerinde öne çıkan cinsler arasında Streptococcus, Prevotella ve Veillonella bulunmaktadır ve bu taksonlar, eş zamanlı olarak toplanan oral numunelerde de tespit edilmiştir. Astımda veya kronik obstrüktif akciğer hastalığında ise Haemophilus ve Moraxella gibi ağız boşluğundan çoğalan patojenik bakterilere, özellikle akciğer mikrobiyotasında çok miktarda rastlanır ve bakteri konsorsiyumunun esas olarak oral ortakçı bakterilerden oluştuğu akciğer dokusundan daha yüksek bir enflamatuar interlökin üretimini indükler. Kistik fibrozda, Pseudomonas aeruginosa’nın, tüm vakaların en az % 50'sinde akciğerdeki baskın takson olduğu düşünülmektedir. Varlığı, hastalığın şiddeti ile ilişkilidir. Ortakçı streptokokların, özellikle Streptococcus salivarius’un akciğer bakteri konsorsiyumunda baskın olduğu zaman ise bu durum, stabiliteyi gösterir.

Son çalışmalar, akciğerdeki mikrobiyotanın, immünolojik homeostaza katkıda bulunduğunu ve disbiyozdan etkilendiğinde potansiyel olarak viral enfeksiyona karşı duyarlılığı değiştirebileceğini göstermiştir. COVID-19 ile ilgili olarak, SARS-CoV-2 pnömonisi olan hastalar ile sağlıklı denekler arasında akciğer mikrobiyota kompozisyonunda oldukça önemli bir fark gözlenmiştir, bu da hastaların akciğer mikrobiyotasında gözlemlenen disbiyozdur (Şekil 2) (6). Ne yazık ki, SARS-CoV-2 pnömonisi olan sadece sekiz hasta değerlendirilmiştir. Bunlardan altısında patojen açısından zenginleştirilmiş bir mikrobiyota, diğer ikisinde de komensal olarak zenginleştirilmiş bir mikrobiyota bulunmaktadır. COVID-19 hastaları arasında sadece bir akciğer mikrobiyotası, Streptococcus cinsinin varlığını göstermiştir ancak tür düzeyinde yapılmış bir analiz mevcut değildir. Akciğer mikrobiyota dysbiosisi, sadece viral agresyonu için daha verimli bir zemin oluşturmakla kalmaz, aynı zamanda hastanın durumunun kötüleşmesine de yol açabilir. Viral enfeksiyonun bilinen yaygın bir komplikasyonunun - özellikle solunum yolu virüsleri için-, ikincil bir bakteriyel enfeksiyon olduğu ve bu enfeksiyonların morbidite ve mortalitede anlamlı bir artışa yol açtığı bilinmektedir. Bu nedenle, COVID-19 hastalarının akciğerlerindeki potansiyel patojenik bakterilerin artmış seviyeleri, sekonder enfeksiyon riskini artırabilir.

Sonuç olarak, Streptococcus salivarius, sağlıklı oral ve üst solunum yolu mikrobiyotalarında baskın bir ortakçı türdür ve bu türün bazı üyelerinin potansiyel olarak patojenik mikropların büyümesine aktif olarak müdahale ettiği gösterilmiştir. Diğer oral ortakçılar ile birlikte, Streptococcus salivarius, akciğer eubiyotik mikrobiyotasının yaygın bir üyesidir ve akciğerdeki varlığı sağlıklı veya daha stabil olan koşullarla ilişkilidir. COVID-19 hastaları, sağlıklı kişilerden anlamlı şekilde farklı olarak, özellikle potansiyel olarak patojenik bakteri türleri ile zenginleşmiş ve önemli ölçüde değişmiş bir akciğer mikrobiyotasına sahiptir. K12 suşu, Streptococcus salivarius'un en ayrıntılı incelenmiş suşudur. Üst solunum yolunun K12 suşu ile kolonizasyonu, muhtemelen, IFN-γ salınımını uyarma ve agresif inflamatuar yanıtları tetiklemeden doğal öldürücü hücreleri aktive etme kabiliyeti nedeniyle hem çocuklarda hem de yetişkinlerde birçok viral üst solunum yolu enfeksiyonunun önemli ölçüde azalmasına neden olur (7). Her ne kadar etkinliği SARS-CoV-2 ile ilgili olarak özellikle değerlendirilmese de klinik potansiyeliyle ilgili yapılan çeşitli gözlemler ve 20 yıldan uzun bir süredir probiyotik olarak uygulanması sayesinde elde edilen güçlü güvenlik profili ile doktorları viral akciğer enfeksiyonlarını ve ilişkili pnömonileri kontrol altına almaya ve konakçı bağışıklık fonksiyonlarını iyileştirmeye yardımcı olması için kullanımını değerlendirmeye teşvik eder.

Acknowledgements: The author wishes to thank Ruth Dilleen for English language revision. Conflicts of Interest: The author works in the scientific department where a finished form of strain K12 has been developed. References 1) Guo YR, Cao QD, Hong ZS, et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Mil Med Res. 2020;7(1):11. 2) Abranches J, Zeng L, Kajfasz JK, et al. Biology of oral streptococci. Microbiol Spectr. 2018;6(5):10.1128/microbiolspec.GPP3-0042-2018. 3) Di Pierro F, Risso P, Poggi E, et al. Use of Streptococcus salivarius K12 to reduce the incidence of pharyngo-tonsillitis and acute otitis media in children: a retrospective analysis in not-recurrent pediatric subjects. Minerva Pediatr. 2018;70(3):240–245. 4) Chilcott CN, Crowley L, Kulkani V, Jack RW, McLellan AD, Tagg J. Elevated levels of interferon gamma in human saliva following ingestion of Streptococcus salivarius K12. Presented at: Joint New Zealand and Australian Microbiological Societies Annual Meeting. Dunedin, New Zealand, 22–25 November 2005. 5) Wang J, Li F, Tian Z. Role of microbiota on lung homeostasis and diseases. Sci China Life Sci. 2017;60(12):1407–1415. 6) Shen Z, Xiao Y, Kang L, et al. Genomic diversity of SARS-CoV-2 in Coronavirus Disease 2019 patients. Clin Infect Dis. 2020;ciaa203. 7) Bouwer AL, Saunderson SC, Dunn AC, et al. Rapid interferon-gamma release from natural killer cells induced by a streptococcal commensal. J Interferon Cytokine Res. 2013;33(8):459–466. Figure 1 Detection of salivary IFN-γ after administration of Streptococcus salivarius K12. From: Chilcott CN et al. Joint New Zealand and Australian Microbiological Societies Annual Meeting. Dunedin, New Zealand, 22–25 November 2005 (adapted).

Minerva Medica EDIZIONI MINERVA MEDICA EDIZIONI MINERVA MEDICA A possible probiotic (S. salivarius K12) approach to improve oral and lung microbiotas and raise defenses against SARS-CoV-2 Journal: Minerva Medica Paper code: Minerva Med-6570 Submission date: March 31, 2020 Article type: Letter to the Editor Files: 1. Manuscript Version: 1 Description: Manoscritto originale File format: application/vnd.openxmlformats-officedocument.wordprocessingml.document 2. Figures 1 Version: 1 Description: Figure 1 e 2 File format: application/pdf

A possible probiotic (S. salivarius K12) approach to improve oral and lung microbiotas and raise defenses against SARS-CoV-2

Francesco Di Pierro (Scientific Director, Velleja Research, Milan, Italy) Correspondence: f.dipierro@vellejaresearch.com Keywords: Streptococcus salivarius, coronavirus, COVID-19, interferon, pneumonia

The coronavirus disease 2019 (COVID-19), a pathology caused by a novel betacoronavirus named SARS-CoV-2, is spreading rapidly and scientists are endeavoring worldwide to develop drugs for efficacious treatments and vaccines to protect human life. SARS-CoV-2 shares 79% sequence identity with SARS-CoV, the virus that caused a major outbreak in 2002–2003. In an identical manner to SARS-CoV, SARS-CoV-2 utilizes the ACE-2 receptor to bind to lung cells where it can cause severe, and possibly fatal, pneumonia. Most cases of transmission occur via person-to-person respiratory droplets and from environmental surfaces to the hands and then to the nose and mouth.

Both pathways allow the virus to reach, as the first step, the upper respiratory tract from where it can spread to the lungs. (1) The oral and the upper respiratory tract microbiotas contain large populations of the genus Streptococcus, with both commensal and pathogenic streptococci competing for several niches using a variety of strategies. For instance, streptococci have a remarkable ability to metabolize carbohydrates via fermentation, thereby generating acids as by-products. Excessive acidification of the oral environment by aciduric species such as Streptococcus mutans is directly associated with the development of dental caries. However, less acid-tolerant species such as Streptococcus salivarius can also produce large amounts of alkali, thereby playing an important role in the acid-base physiology of the oral cavity. Streptococcus salivarius is a numerically-prominent foundation member of the upper respiratory tract microbiota and some members of this species have been shown to exert a bacterial interference versus streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Moraxella catarrhalis and Haemophilus influenzae, pathogens involved in recurrent pharyngitis, tonsillitis and in acute otitis media.(2) A particular strain of Streptococcus salivarius, known as K12, (3) has been clinically demonstrated to play a role in creating a stable upper respiratory tract microbiota capable of protecting the host from pathogenic bacteria, fungi and viruses, thereby reducing the incidence of streptococcal pharyngo-tonsillitis, acute and secretory otitis media, halitosis, oral thrush and viral infections (rhinitis, influenza, pharyngitis, laryngitis, tracheitis and enteritis). The antibacterial role of strain K12 has been attributed to the release of bacteriocins (Salivaricin A2 and Salivaricin B) that can create instability in the membranes of susceptible, pathogenic bacteria. In contrast, the anti-Candida action seems to be mainly due to the ability of strain K12 to compete with fungal hyphae in adhering to oral mucosa. The proposed antiviral capability of strain K12 has been attributed to the observed development of an adaptive immune response as revealed by detection of enhanced levels of IFN-γ in human saliva 10 hours after oral lozenge administration, with values at 24 hours between 22 and 139 pg/ml (Fig.1).(4)

Figure 1:

Intrinsic antiviral activities are mediated by interferon-induced proteins and can cause the induction of nitric oxide synthase, which can directly impacts upon virus viability, affecting RNA degradation in the cell and inducing cell apoptosis. IFN-γ release occurs without modifying either IL-1β or TNF-α levels, and substantially lowering IL-8 release, therefore occurring without evoking an inflammatory response. Moreover, Streptococcus salivarius K12 is capable of suppressing bronchial inflammatory responses by inhibiting NF-κB pathways and other important human immune cell functions. This last finding is important, because viruses have evolved the ability to modulate the NF-κB pathway, thereby enhancing their replication, reducing host cell survival and aiding evasion of host immune responses. Anatomical and physiological considerations indicate that the oral cavity is the primary source of the lung microbiota community, acquired via microaspiration and inhalation.(5) Indeed, the microbiota of healthy lungs overlaps with that found in the mouth. The prominent genera in bronchoalveolar lavage fluid samples from healthy subjects include Streptococcus, Prevotella and Veillonella, and these taxa are also detected in concurrently-collected oral samples. In contrast, in asthma or in chronic obstructive lung disease, oral cavity-derived pathogenic bacteria such as Haemophilus and Moraxella are particularly abundant within the lung microbiota and induce a higher production of inflammatory interleukins than in lung tissue where the bacteria consortium mainly consists of the oral commensal bacteria. In cystic fibrosis, the lungdominant taxon, in at least 50% of all cases, is considered to be Pseudomonas aeruginosa. Its presence correlates with patient disease severity. Conversely, when commensal streptococci, especially Streptococcus salivarius, dominate the lung bacteria consortium, their presence correlates with patient stability. Recent studies have shown that the microbiota in the lung contributes to immunological homeostasis and can potentially, when affected by dysbiosis, alter susceptibility to viral infection. With respect to COVID-19, a highly significant difference in the lung microbiota composition has been observed between patients with SARS-CoV-2 pneumonia and healthy subjects, implying a dysbiosis occurred in the lung microbiota of patients (Fig.2).(6)

Figure 2:

Unfortunately, only eight subjects with SARS-CoV-2 pneumonia have been assessed. Six of these had a pathogen-enriched microbiota, and the other two had a commensal-enriched microbiota. Just one lung microbiota among the COVID-19 patients showed the presence of the genus Streptococcus, with no analysis performed at the species level. Not only can lung microbiota dysbiosis create a more fertile ground for viral aggression, but it can also promote a worsening of the patient condition. It is well known that a common complication of viral infection, especially for respiratory viruses, is a secondary bacterial infection and these infections can contribute to a significant increase in morbidity and mortality. Therefore, the elevated levels of potentially pathogenic bacteria in the lungs of COVID-19 patients could increase the risk of secondary infection. In conclusion, Streptococcus salivarius is a predominant commensal species in healthy oral and upper respiratory tract microbiotas, and some members of this species have been shown to actively interfere with the growth of potentially-pathogenic microbes. Along with other oral commensals, Streptococcus salivarius is a common member of the lung eubiotic microbiota, and its presence in the lung correlates with healthy or more stable conditions. COVID-19 patients have a significantly altered lung microbiota, particularly enriched by potentially pathogenic species of bacteria and markedly different to that of healthy subjects. Strain K12 is the most thoroughly studied strain of Streptococcus salivarius. Colonization of the upper respiratory tract with strain K12 leads to a significantly reduced occurrence of many viral upper respiratory tract infections, both in children and in adults, possibly due to its ability to stimulate IFN-γ release and to activate natural killer cells without triggering aggressive inflammatory responses.(7) Although its efficacy has never been specifically evaluated with respect to SARS-CoV-2, the various observations of its clinical potential, together with its strong safety profile extending over more than 20 years of probiotic application, may prompt physicians to consider using it as an adjunct to help control viral lung infections and associated pneumonias and to improve host immune functions.

Acknowledgements: The author wishes to thank Ruth Dilleen for English language revision. Conflicts of Interest: The author works in the scientific department where a finished form of strain K12 has been developed.

References 1) Guo YR, Cao QD, Hong ZS, et al. The origin, transmission and clinical therapies on coronavirus disease 2019 (COVID-19) outbreak - an update on the status. Mil Med Res. 2020;7(1):11. 2) Abranches J, Zeng L, Kajfasz JK, et al. Biology of oral streptococci. Microbiol Spectr. 2018;6(5):10.1128/microbiolspec.GPP3-0042-2018. 3) Di Pierro F, Risso P, Poggi E, et al. Use of Streptococcus salivarius K12 to reduce the incidence of pharyngo-tonsillitis and acute otitis media in children: a retrospective analysis in not-recurrent pediatric subjects. Minerva Pediatr. 2018;70(3):240–245. 4) Chilcott CN, Crowley L, Kulkani V, Jack RW, McLellan AD, Tagg J. Elevated levels of interferon gamma in human saliva following ingestion of Streptococcus salivarius K12. Presented at: Joint New Zealand and Australian Microbiological Societies Annual Meeting. Dunedin, New Zealand, 22–25 November 2005. 5) Wang J, Li F, Tian Z. Role of microbiota on lung homeostasis and diseases. Sci China Life Sci. 2017;60(12):1407–1415. 6) Shen Z, Xiao Y, Kang L, et al. Genomic diversity of SARS-CoV-2 in Coronavirus Disease 2019 patients. Clin Infect Dis. 2020;ciaa203. 7) Bouwer AL, Saunderson SC, Dunn AC, et al. Rapid interferon-gamma release from natural killer cells induced by a streptococcal commensal. J Interferon Cytokine Res. 2013;33(8):459–466. Figure 1 Detection of salivary IFN-γ after administration of Streptococcus salivarius K12. From: Chilcott CN et al. Joint New Zealand and Australian Microbiological Societies Annual Meeting. Dunedin, New Zealand, 22–25 November 2005 (adapted).